۳-۲ آنالیز بیوانفورماتیکی ناحیه V پروتئین ALCAM
۳-۲-۱ استخراج توالی مورد نظر
توالی مورد نظر از طریق سایت های Swiss-port / UniprotKB و مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی^[۱۰۱](NCBI) بدست آورده شد . سپس در انتهای ۳’ توالی ، ۶ اسید آمینه ی هیستیدین (His-Tag ) قرار داده شد و کدون پایان (TAA ) هم بعد از آن قرار گرفت . در انتها نیز جایگاه های برش آنزیمی برای آنزیم های محدود کننده NcoI و BamHI در سر ‘۵ توالی و جایگاه برش آنزیمی برای آنزیم محدود کننده XhoI در سر ‘۳توالی قرار داده شد .

۳-۲-۲ بهینه سازی توالی یا Optimization
از انجایی که ثابت شده فرایند گلیکوزیلاسیون بر نحوه اتصال این پروتئین در واکنش های هموفیلیک ( (ALCAM-ALCAMتاثیری ندارد میزان پروکاریوتی E.Coli برای فرایند کلونینگ انتخاب شد . به منظور دسترسی به بیشترین میزان بیان صحیح در میزبان پروکاریوتی توالی ۶۶۲ نوکلئوتیدی دومین V توسط شرکت Genscript ایالات متحده آمریکا بهینه سازی شد. پارامترهایی که توسط این شرکت برای فرایند بهینه سازی در نظر گرفته شد، شامل موارد زیر می شود :
الف-codonusage میزبان
ب-محتوای CG
پ-ساختارmRNA پیش بینی شده
ت-از بین بردن نواحی برش ناخواسته
ث-جایگاه هایآنزیمی آنزیم های محدودالاثر که ممکن است در فرایند کلونینگ اختلال ایجاد کنند.
ج-به حداقل رساندن نواحی تکرار شونده مستقیم یا غیر مستقیم
۳-۳ سنتز شیمیایی DNA ناحیه V پروتئین ALCAM
۳-۳-۱ سنتز شیمیایی ژن نوترکیب
توالی طراحی شده کایمر مورد نظر توسط شرکت Biomatikکانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد .
۳-۳-۲ پایداری و شرایط نگهداری DNAسنتز شده
DNAلیوفیلیزه شده می تواند توسط بافر TEاستریل یا آب بدون نوکلئاز در PHطبیعی با توجه به امکانات محیط آزمایشگاه بصورت محلول تهیه شود . بعد از محلول سازی می توان آن را در دمای بین۲۰- تا ۸۰- درجه سانتیگراد برای مدت طولانی نگهداری کرد . DNA لیوفیلیزه شده، محلول شده به کمک بافر TEمی تواند به مدت ۶ ماه در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شود در حالی که اگر از آب برای محلول سازی استفاده شود امکان نگهداری در ۴ درجه سانتیگراد وجود ندارد.
۳-۳-۳ محلول سازی DNA لیوفیلیزه
قبل از باز کردن تیوب حاوی DNA ، ابتدا به مدت کوتاهی تیوب سانتریفیوژ شد تا DNA های متصل به دیواره جدا شوند . در صورت عدم سانتریفیوژ ممکن است مقداری از ذخیره ی DNA از دسترس خارج شود.
الف- استوک اصلی: µg10 از DNAلیوفیلیزه در µg100 از بافر TEحل شد.
TEاز بافر۱۰µg از استوک اصلی در۱µg ب- استوک مورد استفاده: در یک میکروتیوب دیگر
۱۰رسید) ng/ µlحل شد.(غلظت نهایی به
۳-۴ کلونینگ پلاسمید- AMP⁺ pBSK حاوی DNA ناحیه v پروتئین ALCAM
جهت تکثیر پلاسمید حاوی ژن ناحیه Vپروتئین ALCAM مراحل زیر طی شد:
۳-۴-۱ آماده سازی باکتری شایسته
جهت اماده سازی باکتری Top 10برای پذیرش پلاسمید ابتدا باید ان را کامپتنت یا شایسته سازی، برای پذیرش پلاسمید کرد.
۳-۴-۱-۱ مواد و محلول ها
محلول کلرید کلسیم ۰٫۱ مولار
LB براث بدون آنتی بیوتیک
LB براث حاوی آمپی سیلین ( پس از ساختن براث و سپس سرد شدن ان بعد از اتوکلاو کردن، آمپی سیلین به محیط کشت افزوده شد . )
LB آگار حاوی آمپی سیلین ( روش تهیه دقیقا مشابه LB براث است )
۳- ۴-۱-۲ روش کار
۱- باکتری در محیط کشت فاقد آمپی سیلین کشت داده شد.
۲- پس از ۲۴ ساعت نگهداری در انکوباتور ، یک تک کلونی را انتخاب کرده و به ۵ میلی لیتر محیط LB مایع بدون آمپی سیلین تلقیح کرده و سپس به مدت یک شب تا صبح در شکیرانکوباتور قرار داده تا باکتری رشد کنند.
۳- یک میلی لیتر از محیط فوق را به ۵ میلی لیتر محیط LB تازه تلقیح نموده و مجددا در شیکرانکوباتور قرار می شود . ۲ تا ۳ ساعت بعد محیط کدورت مناسب یعنی جذب ۵/۰ تا ۸/۰ در۵۰۰ نانومتر خواهد داشت.
۴- باکتری هایی که به این طریق تازه گشته و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل توزیع کرده و ۵ الی ۱۰ دقیقه روی یخ نگه شود .
۵- میکروتیوب ها ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ شود.
۶- مایع رویی را دور ریخته و رسوب باکتری در یک میلی لیتر محلول استریل ۱/۰ مولار کلرید کلسیم حل شود .
۷- ۲۰ تا ۳۰ دقیقه محلول مذکور روی یخ انکوبه شود.
۸- این بار رسوب در ۶۰۰ میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل ۱/۰ مولار حل شود.
۹- ۲۰ تا ۳۰ دقیقه محلول روی یخ انکوبه شود.
۱۰- سپس محلول به مدت ۳ دقیقه در۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ شود.
۱۱- رسوب در ۳۰۰ میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل شود.
۱۲- به مدت ۲۰ دقیقه محلول بر روی یخ قرار گیرد.
این باکتری ها تا ۷۲ ساعت روی یخ در یخچال قابل نگهداری می باشند و می توان با افزودن گلیسرول استریل ۳۰ درصد آن ها را در ۷۰- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
۳-۴-۲ ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10E.coli
بدین منظور از سویه E.coliTop10که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده می شود . این باکتری به تنهایی حساس به آمپی سیلین است ولی وقتی وکتور را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک مقاوم شده و بر روی آگار حاوی آمپی سیلین تشکیل کلونی می دهد .
۳-۴-۲-۱ روش کار:
مراحل کار به ترتیب زیر است:
۱- ۵۰ میکرولیتر سوسپانسیون سلولی شایسته ابتدا روی یخ ذوب شود.