۳-۳۴- تعداد و انواع موتاسیون­های نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-4

۳-۳۵- مشخصات موتاسیون­های نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیم­ های برشی در قطعه تکثیری …

۳-۳۶- دسته بندی ژنوتیپ­ها

۳-۳۷- مشخصات گروه هاپلوتیپی

۳-۳۸- مشخصات آماری SNPهای بالقوه و واقعی در دسته سوم

۳-۳۹- مشخصات آماری SNPهای واقعی و هاپلوتیپ­ها در دسته سوم

۳-۴۰- مشخصات کامل SNPهای بالقوه در دسته سوم

۳-۴۱- مشخصات مورفولوژیکی سه هاپلوتیپ شناخته شده در آزمایش

ز
مقدمه:
افزون بر ۲۰% از اراضی کشاورزی و نزدیک به نیمی از زمین های آبی در دنیا متأثر از مشکل شوری هستند که این، عامل محدود کننده رشد و نمو گیاهان در سراسر جهان و مشکلی جدی برای تولید محصول کشاورزی می­باشد (۲۸). شوری خاک یکی از مهمترین مشکلات محیطی است که تولید محصول زراعی را تحت تاثیر قرار می­دهد (۵۱). لذا، فهم مکانیسم های تحمل به شوری بسیار با اهمیت است (۱۵). عملکرد گیاهان زراعی تحت تأثیر تنش­های زنده و غیر زنده بیش از ۵۰% کاهش می­یابد (۱۴۶). افزایش شوری خاک یا آب موجب ایجاد اختلال در فرآیندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه شده و باعث بروز مشکلاتی مانند ۱) عدم تعادل یونی ۲) کمبود مواد معدنی ۳) تنش اسمزی ۴) سمَیَت یونی و تنش اکسیداتیو می­گردد (۶۴). این شرایط با اجزای سلولی همانند DNA، لیپیدها و رنگدانه ها اثر متقابل می­یابد (۱۳۴) و رشد و نموَ اکثر گیاهان زراعی را کاهش می­دهد. تحمل نسبت به شوری صفتی چند ژنی است که شامل الف) تقسیم بندی مقادیر زیاد نمک در داخل گیاه ب) تنظیم اسمزی و ج) تغییرات مورفولوژیکی می­باشد (۸۴). مطالعاتی که در زمینه تحمل به تنش شوری انجام گرفته است شامل: ۱- برنامه های اصلاح کلاسیک که علی رغم برخی موفقیت­ها، به دلیل ماهیت چند ژنی بودن این صفت محدود گردیده است، ۲- استفاده از موتاسیون­هایی که منجر به از بین رفتن و حذف عملکرد ژن می­گردند برای شناسائی و مطالعه ژن­های مسئول تنش. برای مثال در آرابیدوپسیس، به دلیل سهولت در دستکاری ژنتیکی این گیاه (۶)، تحقیقاتی در این زمینه انجام گرفته است و ۳- روش های کشت آزمایشگاهی در گیاهانی مانند یونجه (۱۵۴)، برنج (۷۷ و ۱۵۵) و سیب زمینی (۹۳) می­باشد. توسعه گیاهان دارای پتانسیل ژنتیکی بالقوه برای تحمل نسبت به این تنش، به کاهش استفاده از آب نیز کمک می­ کند (۲۷). افزایش گیاهان متحمل (۱۲۴) همراه با مهندسی ژنتیک نتایج خوبی را از نظر احتمال انتقال سریع و دقیق صفات مطلوب به داخل گیاهان مورد نظر، بدون حضور ژن های مضر از خویشاوندان نزدیک گیاه، نشان داده است (۱۱۱). زیرا در این روش، از انتقال مناطق ناخواسته کروموزومی ممانعت می­گردد (۱۱۲ و ۲۰). استفاده از ظرفیت داخلی گیاه، تحمل آن نسبت به این تنش را تقویت می­ کند و مهندسی ژنتیک مدرن به انتقال صفات مطلوب کمک می­نماید (۹۴).

جو یکی از متحمل­ترین گیاهان زراعی است که طی سال­ها، از روش­های مختلف فیزیولوژیکی برای تعیین تنوع فنوتیپی تحمل به شوری در این گیاه استفاده شده است (۱۴۹). ذخایر ژنی جوی زراعی در مقایسه با انواع وحشی آن تنوع ژنتیکی محدودی را نشان دادند که این امر بیانگر لزوم توسعه ارقام سازگار می­باشد (۱۰۵). گزارش شده است که جمعیت هایی که در مناطق تحت تنش شوری رشد می­یابند دارای تنوع ژنتیکی گسترده­تری هستند (۸۸). از نظر میزان محصول دانه در محیط شور، جو یکی از اعضای متحمل به شوری در تیره تریتیاسه است (۶۹). مکانیسم تحمل به شوری در این تیره عموماً شامل تجمع یون سدیم در طول دوره رشد گیاه می­باشد (۱۵ و ۱۳۸). از نقطه نظر تجمع این یون در تیره تریتیاسه، گیاه جو دارای تنوع ژنتیکی بالایی است. شوری یکی از موانع اصلی افزایش تولید محصول در جو بوده و تحمل به این تنش در مراحل مختلف رشد گیاه متفاوت است. حساس­ترین مراحل رشد گیاه در مقابل تنش شوری در جو دو مرحله جوانه زنی و گیاهچگی می­باشد و با افزایش سن گیاه میزان تحمل آن نیز افزایش می­­یابد. تأثیر این تنش در مرحله جوانه زنی جو بیشتر مربوط به اثرات یونی است (۱۳۴)، در حالیکه در مرحله گیاهچگی تنش شوری حاصل اثرات اسمزی می­باشد (۷۴). بین تحمل به شوری در دو مرحله رشدی جوانه­زنی و گیاهچگی هیچ رابطه­ای وجود ندارد (۷۴). مکانیسم­های تحمل به شوری در جو شامل موارد زیر است: ۱- انتقال یون سدیم از برگ­های گیاه جو به داخل واکوئول که موجب کاهش سمَیَت این یون می­ شود (۳۸) و ۲- توزیع بیشتر یون پتاسیم موجود در برگ­های جو به داخل سلول­های مزوفیل نسبت به توزیع آن­ها در سلول­های اپیدرم که موجب افزایش نسبت یونی پتاسیم به سدیم در سیتوپلاسم سلول­های مزوفیل می­ شود و این وضعیت برای ثبات فتوسنتز با اهمیت است (۵۶).
استراتژی­ های حفاظت در مقابل آسیب ناشی از شوری در جو عبارت از استراتژی های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی است. تغییر عملکرد ژن راهی موثر برای تغییر این وضعیت است. بنابراین یک مرحله اساسی، درک مکانیسم مولکولی پاسخ به تنش است که در این مرحله، ژن­های کنترل کننده تنش و گیاهان ترانس ژنیک دارای تحمل بالا نسبت به این تنش شناسایی می گردند (۶۵).
دو ژن CBL4 و HKT1 نقش مهمی در تحمل گیاه جو نسبت به تنش شوری دارند که نقش و اهمیت آن­ها به طور خلاصه ذکر می­گردد. سیگنال­های حاصل از یون کلسیم، مبدَل­ها و تنظیم کننده­ های اصلی در فرآیندهای سازگاری و نموَی گیاهان هستند. این سیگنال­ها به واسطه اثرات تحریکی خاص ناشی از فعال شدن همزمان کانال­ها، پمپ­ها و انتقال دهنده­هایی که به صورت دمائی و فضایی افزایش یون کلسیم را نشان می­ دهند، بروز می­یابند (۵۹). مشخص­ترین مسیر سیگنال­دهی که مختص تنش شوری است نیز شامل افزایش یون کلسیم در سیتوسول می­باشد (۱۶۱). در این مسیر، افزایش القائی یون سدیم در سیتوسول احتمالاً از طریق یک پروتئین calcineurin B-like به نام CBL4 که اصولاً تحت عنوان SOS3 شناخته شده است، تشخیص داده می­ شود. کمپلکس CBL4/CIPK24 (SOS3/SOS2) از طریق زنجیره اسید چرب مریستول با CBL4/SOS3 پیوند کووالانسی تشکیل می­دهد (Ishitani, 2000) که موجب فسفریلاسیون و در نتیجه فعال شدن آنتی ریپورتر Na⁺/H⁺ موجود در بخش مرزی غشاء یعنی SOS1 می­گردد (۱۰۴، ۱۰۶ و ۱۲۶). سیستم سیگنال­دهی CBL/CIPK برای ترجمه سیگنال­های یون کلسیم به شکل فسفریلاسیون پروتئینی است که کمپلکس­های شرکت کننده در پروتئین­های CBL و CIPK هایی را که با آن­ها اثر متقابل دارند، مانند AKT1، ترانسپورتر یون پتاسیم در آرابیدوپسیس یا SOS1، عامل حساسیت عمومی نسبت به شوری یا CHL، ترانسپورتر نیترات یا AHA2 و H⁺ATPase 2 در آرابیدوپسیس، را مشخص می­ کند (۸۶). چند نوع CBL وجود دارد مانند CBL1، CBL4 و CBL9، که با اعضای غشائی در ارتباط هستند (۵۴ و ۶۸). در مورد CBL4/SOS3، نشان داده شده است که مریستوله شدن برای تحمل به شوری مهم و ضروری بوده است (۵۴). اولین CBL شناخته شده با روش ژنتیکی SOS3/CBL4 بوده است. این نشان می­دهد که SOS3/CBL4 در تحمل به شوری از طریق حس­گر یون کلسیم دارای نقش اختصاصی می­باشد. ژن­هایی که گیاه را قادر به محدود کردن تجمع یون سدیم در بافت شاخه می­نمایند دارای منابع بالقوه­ای از تحمل نسبت به شوری در اصلاح نباتات هستند. در جو، لوکوس HvNaX4 مقدار یون سدیم در شاخه را بین ۱۲ و ۵۹ درصد کاهش می­دهد. بسته به شرایط هیدروپونیک و نوع خاک تأثیر قوی محیط روی بیان این ژن مشخص می­گردد (۱۱۲). لوکوس ژنی HvCBL4 در جو با ژن متحمل به شوری SOS3 در آرابیدوپسیس همولوگ بوده و با HvNaX4 به طور همزمان تفرق می­یابد (۱۱۲).
تحمل به شوری در گیاهان می ­تواند وابسته به عامل انتقال دهنده HKT^[1] باشد که این مولکول اختصاصاً انتقال یون­های سدیم یا انتقال یون­های سدیم و پتاسیم را تسهیل می­نماید (۸۶ و۱۳۲) و در تنظیم هموستازی یون سدیم نقش مهمی ایفاء می­ کند. در آرابیدوپسیس تالیانا تنها یک ژنHKT (144) و در برنج ۸ ژنHKT (33 و ۴۸) وجود دارد. این ژن براساس تشابه توالی آمینو اسیدی دارای دو زیر خانواده می­باشد (۱۰۰) که آنها از نظر انتخاب دو یون سدیم و پتاسیم متفاوت هستند ((۳۳، ۴۸ و ۷۲). اعضای ژنی زیر خانواده اول همگی اجزای انتقال دهنده اختصاصی یون سدیم بوده و اعضای زیر خانواده دوم انتقال دهنده همزمان دو یون سدیم و پتاسیم یا انتقال تک یون سدیم و یا پتاسیم می باشند به استثنای ژن OsHKT2,2 (Oshkt2) در برنج.

شکل ۱- شبکه سیگنال­دهی CBL-CIPK در پاسخ به تنش­های غیر زنده
محققان گزارش دادند که تحمل نسبت به شوری به طور معنی داری با نسبت یون پتاسیم به یون سدیم مرتبط است (۱۰۵). آنالیز ترکیبی نشان داد که HvHKT1 اصولاً انتقال یون سدیم را تحت شرایط تنش کنترل می­ کند، که این نتیجه ­گیری با آنالیز بیشتر بیان ژن تأیید گردید. همچنین گزارش شده است که در جمعیت­هایی که در محیط تحت تأثیر تنش رشد می­یابند، طیف وسیعی از تنوع ژنتیکی وجود دارد (۸۸). در جو، مطالعه شده است که بیان ژن HKT1 به وسیله یون پتاسیم تنظیم می­ شود (۱۵۰). همچنین گزارش شده است که خانواده­های ژن HKT در هموستازی یون سدیم نسبت به یون پتاسیم دخالت می­نمایند که این نشان دهنده اهمیت آن­ها در تحمل نسبت به شوری است (۴۳). چند مکانیسم در سازگاری­های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی دخالت دارند که احتمالاً در حفظ نسبت پائین یون سدیم به یون پتاسیم در سیتوپلاسم نقش دارند. در جو (هوردئوم وولگار)، دو تا از این مکانیسم­ها وجود دارد که شامل انتقال یون سدیم به داخل واکوئول در عرض غشای تونوپلاستی و انتقال یون سدیم به محیط خارج در سراسر غشای پلاسمائی می­باشد (۳۲ و ۹۹). توزیع درون سلولی یون سدیم شامل پمپاژ این یون به داخل واکوئول قبل از افزایش غلظت آن در سیتوپلاسم است (۱۳۸). این فرایند از طریق یک شیب گرادیانت pH که به وسیله جابجایی پروتونی H⁺-ATPase و پیروفسفاتاز غیر آلی ایجاد می­گردد، تسریع می­ شود (۳۱، ۳۷، ۶۲ و ۱۴۵). افزایش فعالیت آنتی­ریپورتر Na⁺/H⁺ به دلیل افزایش یون سدیم در ریشه ­های هوردئوم وولگار گزارش شده است (۳۲). مطالعات متعدد اخیر وجود تنوع در تحمل به شوری در میان ارقام هوردئوم وولگار را گزارش نموده است (۶۶ و ۱۱۵). تحمل به شوری در گیاهان بستگی به ترانسپورترهای HKT دارد که این ترانسپورترها واسطه انتقال اختصاصی یون سدیم یا انتقال همزمان یون سدیم و پتاسیم هستند. ترانسپورترهای HKT دارای دو نقش می­باشند: ۱- جذب یون سدیم از محلول خاک برای کاهش یون پتاسیم مورد نیاز هنگامی که یون پتاسیم عامل محدود کننده است و ۲- کاهش تجمع یون سدیم در برگ­ها با انتقال آن­ها به داخل فضای آوند چوبی و یا انتقال آن­ها به داخل فضای آوند آبکش (۱۱۳).
شکل۲- مسیر اختصاصی سیگنال دهی گیاه در پاسخ به تنش شوری (۸۶)
تکنیک اکوتیلینگ
تعیین خصوصیات فنوتیپی جمعیت­های بزرگ یا مجموعه­های بزرگ بانک ژنی مشکل و دشوار است. راه­حل آن، استفاده از روشی برای صرفه جوئی در زمان و هزینه می­باشد. همچنین، توانایی عملی برای تأیید نقش توالی­های ژنی که از طریق برنامه ­های بررسی بیان توالی ژن در آزمایشات بزرگ به دست می­آیند متناسب با سرعت کشف و یافتن آن­ها نمی ­باشد. در نتیجه، تعداد زیادی توالی DNA وجود دارد که از طریق تفسیر الکترونیکی با ژن­ها یا پروتئین­هایی که قبلاً خصوصیات آن­ها تعیین شده همولوژی ندارند و بدین وسیله هیچ عملکرد بالقوه­ای برای آن­ها در نظر گرفته نمی­ شود (۱۱). به علت وجود اطلاعات زیاد در مورد توالی­های ژنی و فقدان آگاهی از عملکرد و نقش آن­ها، و نیز برای پر کردن فاصله بین ساختار و نقش این توالی­ها تحقیقات زیادی در زمینه ژنتیک معکوس انجام گرفته است (۶۴). با بهره گرفتن از ابزار مولکولی و ژنتیکی، یک صفت موتانت با یک توالی از DNA که عملکرد آن قبلاً شناخته شده است، مرتبط می­گردد (۱۷ و ۴۶). اکوتیلینگ روشی است که با آن می­توان به سرعت و به سادگی پلی­مورفیسم­های طبیعی (پلی­مورفیسم­های تک نوکلئوتیدی (SNP) یا حذف و اضافه­های کوچک) را در ژن مورد نظر تعیین نمود (۱۶). این تکنیک بر مبنای تشخیص موتاسیون است و اولین بار توسط کومای و همکاران معرفی گردید که در واقع از تکنیک تیلینگ برای یافتن موتاسیون­ در جمعیت طبیعی آرابیدوپسیس تالیانا استفاده گردید. این روش برای جو(Hordeum vulgar L.) (76)، هندوانه (Cucumis melo L.) (91)، گندم(Triticum aestivum L.) (152)، بادام زمینی وحشی (Arachis duranensis K & G) (109) و در تعدادی از گیاهان آبزی مانند (Monochoria vaginalis B.)(151) به کار برده شد. با بهره گرفتن از این روش، تعیین آلل­های مختلف ژن­های هدف و کاهش تعداد نمونه­هایی که باید تعیین فنوتیپ گردند، امکان­ پذیر می­ شود. معمول­ترین شکل تنوع ژنتیکی SNP است، به خصوص آلل­های نادری که فراوانی آن­ها کمتر از ۵% است نقش مهمی در فنوتیپ ایفاء می­نمایند. اثرات بسیار مؤثر آلل­های نادر روی صفات کمّی و بیماری­های پیچیده در تحقیقات زیادی گزارش شده است (۱۴ و ۱۱۴). برخی از SNP ها از طریق تغییر توالی آمینو اسید یا ناقص کردن پروتئین­ها عملکرد ژن را تغییر می­ دهند (۱۰۹).
مزیت­های تکنیک اکوتیلینگ شامل موارد زیر است: ۱- این تکنیک در همه گیاهان و جانوران، حتی گونه ­هایی که قادر به موتانت زایی نیستند، قابل کاربرد است (۳۵)، ۲- قابلیت تعیین تنوع در تعداد تکرار ستلایت­ها (SSRs) را دارد (۱۳۹)، ۳- قابلیت تعیین سطوح هتروزیگوسیتی در گونه­ های دگرگشن با هتروزیگوسیتی بالا را دارد (۳۵) و ۴- ظرفیت تشخیص پلی مورفیسم­های چند گانه در یک قطعه مجزا را دارد (۱۳۹). مزایای تکنیکی روش اکوتیلینگ در مقایسه با سایر روش­های مولکولی به این دلیل است که روش­های ارزیابی بر اساس حرکت ژل، مانند الکتروفورز ژل گرادیانت (DGGE) و پلی مورفیسم­های تک رشته­ای (SSCP) قادر نیستند محل و نوع پلی مورفیسم در قطعه DNA را تعیین کنند (۲۱). تکنیک­های دنیچره کردن و PCR نیز صرفاً برای قطعات کوچک DNA استفاده می­شوند و تکنیک مبتنی بر آرایه می ­تواند ۵۰% از SNPها را بیابد و در این میان، روش توالی­یابی برای این منظور بسیار مناسب و دقیق می­باشد. این روش در گذشته برای ارزیابی جمعیت­های بسیار بزرگ پر هزینه بود اما امروزه با پیشرفت سریع در تکنیک­های توالی­یابی به عنوان روشی کم هزینه­تر و با راندمان بالاتر و همچنین استفاده از نرم افزارهایی که تجزیه و تحلیل داده ­های توالی­یابی را تسریع و تسهیل می­ کنند، کاربرد این تکنیک بیش از پیش مورد توجه قرار گرفته است. به گونه ­ای که اخیراً یکی از جدیدترین تکنیک­های تیلینگ و اکوتیلینگ انجام این روش­ها با بهره گرفتن از توالی­یابی است که با صرف هزینه کم­تر و در مدت زمان کوتاه­تر برای مطالعه تنوع در ژن­های چند آللی در جمعیت­های موتانت و طبیعی به کار می­رود. با بهره گرفتن از روش توالی­­یابی، ضمن برخورداری از کلیه مزایای تیلینگ و اکوتیلینگ، میزان سرعت و دقت در یافتن پلی مورفیسم­های تک نوکلئوتیدی و نیز سایر انواع پلی مورفیسم­ها به حداکثر می­رسد (۳۵).
هدف از این تحقیق، تعیین تنوع آللی ژن­های کاندیدای تحمل به تنش شوری در ارقام و ژنوتیپ­های جو، جستجوی آلل­های جدید، آنالیز روابط فیلوژنی میان ژنوتیپ­های مورد مطالعه، و طبقه ­بندی ژنوتیپ­ها در قالب گروه ­های هاپلوتیپی بوده است. بدین منظور، از تکنیک اکوتیلینگ به کمک توالی یابی^[۲] که یک تکنیک مدرن و بسیار کارآ می­باشد برای یافتن انواع پلی­مورفیسم­های نوکلئوتیدی در دو ژن CBL4 و HvHKT1 (ژن­های کنترل کننده تنش شوری) در ارقام مورد مطالعه جو در این تحقیق استفاده گردیده است. این دو ژن در کنترل شوری نقش بسیار مهم و اساسی دارند. در مطالعه حاضر، از تنوع نوکلئوتیدی این ژن­ها در ارقام و ژنوتیپ­های متعلق به مناطق مختلف شور در دنیا برای یافتن منابع جدید و بالقوه تحمل به تنش شوری استفاده شده است. ضرورت انجام چنین تحقیقی این بوده است که علی­رغم تحقیقات فراوان در زمینه اصلاحات ژنتیکی و وجود مکانیسم­های سازگاری، بسیاری از گیاهان با مشکل کاهش عملکرد مواجه می­باشند. یکی از عوامل اصلی کاهش عملکرد در گیاهان به ویژه گیاهان زراعی، اثرات سوء تنش­های غیر زنده است. از میان تنش­های غیر زنده، تنش شوری یکی از عوامل بسیار مهم کاهش عملکرد و هدر رفتن محصول گیاهی است. لذا، این تحقیق با هدف یافتن منابع بالقوه مقاومت به شوری در ژنوتیپ­های جو اجرا گردیده است.
فصل اول- بررسی منابع:
پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) به صورت یک تغییر تک بازی در توالی DNA که با نسبت معنی داری (بیش از یک درصد) در یک جمعیت بزرگ اتفاق می­افتد، تعریف می­ شود. SNPها در سراسر ژنوم در چهارچوب الگوهای خاصی به نام بلوک هاپلوتیپی حفظ می­گردند. پلی­مورفیسم­های SNP به این دلیل مفید هستند که اغلب با یک صفت خاص مرتبط می­باشند و به آن­ها صفات وابسته به ژنتیک گفته می­ شود. هاپلوتیپ­ها مجموعه ­ای از مارکرهای ژنتیکی پیوسته با هم روی یک کروموزوم هستند که با یکدیگر توارث می­یابند و با نوترکیبی به راحتی از یکدیگر جدا نمی­شوند. از تکنیک اکوتیلینگ می­توان برای طبقه بندی هاپلوتیپی ژنوتیپ­ها استفاده نمود. اولین بار، کومای و همکاران (۲۰۰۴) با بهره گرفتن از تکنیک اکوتیلینگ پلی­مورفیسم DNA را در جمعیت­های طبیعی آرابیدوپسیس تالیانا مطالعه نمودند. آن­ها در ۵ ژن از ۱۵۰ گیاه، ۵۵ هاپلوتیپ یافتند که این هاپلوتیپ­ها طیفی از تفاوت­ها از جمله پلی­مورفیسم تک نوکلئوتیدی تا هاپلوتیپ­های پیچیده را نشان دادند. کوکر­ام و همکاران (۲۰۰۷) نیز با کمک این تکنیک هاپلوتیپ­های دو ژن VRN-H1 و VRN-H2 را در ۴۲۹ واریته جو تعیین نمودند. آنالیز ژنوتیپی، داده ­های توالی­یابی اینترون یک و آزمون­های عادت رشدی این گیاه وجود سه آلل جدید VRN-H1 را نشان داد و فراوان­ترین نوآرایی­های اینترون یک را تعیین نمود. آنالیز ترکیبی آلل­های VRN-H1 و VRN-H2 موجب طبقه ­بندی ۷ هاپلوتیپ چند لوکوسی VRNH1/VRNH2 گردید که سه تا از آن­ها در ۷۹% از واریته­ها وجود داشتند. سینگ و همکاران (۲۰۱۰) هاپلوتیپ­های SNP در ژن BADH1 را در ۱۲۷ واریته و نژاد بومی برنج مورد مطالعه قرار دارند. محصول پروتئینی این ژن (بتائین گلیسین) آنزیمی است که در بسیاری از گونه­ ها به عنوان یک اسموپروتکتنت قوی در مقابل تنش شوری و خشکی عمل می­ کند. این محققان از طریق توالی­یابی مجدد واریته­های مختلف برنج که از نظر تحمل به شوری و داشتن عطر متنوع هستند SNPهای مربوط به ژن BADH1 را پیدا نموده و تأیید کردند. آن­ها SNP 17 در اینترون و SNP 3 در اگزون یافتند که هر سه SNP اگزونی موجب تغییردر آمینو اسید همراه با تغییر معنی­دار عملکرد ژن گردیدند. در ارزیابی­های مرکب SNP در ۱۲۷ واریته مختلف برنج مجموعاً ۱۵ هاپلوتیپ گزارش گردید که ۴ تا از آن­ها با دو هاپلوتیپ پروتئینی مرتبط بودند و در ۸۵% از ارقام وجود داشتند. نتایج این مطالعه نشان داد که واریته­های معطر برنج رابطه خاصی با هاپلوتیپ پروتئینی BADH1 که موجب تبدیل اسید آمینه­های لیزین به آسپاراژین و لیزین به گلوتامین گردید، نشان دادند. چن و همکاران (۲۰۱۱) با بهره گرفتن از روش تغییر یافته اکوتیلینگ، SNPهای ژن VRN-A1 را در گندم (Triticum aestivum L.) تعیین نمودند. آن­ها SNP های این ژن را در ۱۰۶ ژنوتیپ از واریته­های هگزاپلوئید گندم جستجو کرده و از فنوتیپ زمستانه یا بهاره بودن برای طبقه ­بندی هاپلوتیپی آن­ها استفاده کردند. آن­ها سه هاپلوتیپ، هر یک با ۵، ۶ و ۳ تغییر نوکلئوتیدی یافتند. سه تا از این SNPها با بهاره بودن گندم مرتبط بود. آن­ها از اکوتیلینگ قطعات DNA روی ژل آگارز برای تشخیص SNPها استفاده کردند و گزارش نمودند که این روش برای تعیین SNPها در ژن­های گیاهان پلی­پلوئید مانند گندم کارآیی دارد. ژانگ و همکاران (۲۰۱۱) ژن desmoglein 4 (DSG4) در گوسفند را که نقش مهمی در تنظیم رشد و تمایز فولیکول­های مو در پستانداران دارد مورد مطالعه قرار دادند. آن­ها یک قطعه bp 755 از این ژن را در ۵۴۴ نمونه گوسفند متعلق به ۹ نژاد بومی چین و دو نژاد غربی غربال نموده و در دو قطعه از سه قطعه مورد بررسی پلی مورفیسم مشاهده کردند. نکته جالب این بود که پلی­مورفیسم­ها در این دو قطعه دارای عدم تعادل لینکاژی قویی بودند. آن­ها سه هاپلوتیپ یافتند. توالی­های سه هاپلوتیپ ۷ پلی­مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNPs) و یک حذف و اضافه TTG را نشان دادند که موجب جابجایی ۵ آمینواسید و حذف و اضافه آمینو اسید گلیسن گردید. شبیر و همکاران (۲۰۱۱) در دو نژاد بوفالوی جعفر آبادی و سورتی هاپلوتیپ­ها و فیلوژنی مرتبط با ۲۰ توالی نوکلئوتیدی ژن OLR1 را آنالیز و بررسی نمودند. آن­ها در جمعیت مورد مطالعه خود چهار هاپلوتیپ با فراوانی­های ۰۵/۰، ۱/۰، ۱۵/۰ و ۷/۰ یافتند. همچنین آن­ها داده ­های خود را براساس همولوژی مناطق ژنی مورد بررسی در چهار گروه طبقه بندی نمودند. بنابراین نتیجه ­گیری می­گردد که تکنیک اکوتیلینگ کارآئی بالایی در طبقه بندی هاپلوتیپ­ها، تعیین رابطه آن­ها با صفات مورفولوژیکی و تخمین فراوانی آن­ها دارد.