۳-۳۴- تعداد و انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-4
۳-۳۵- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیم های برشی در قطعه تکثیری …
۳-۳۶- دسته بندی ژنوتیپها
۳-۳۷- مشخصات گروه هاپلوتیپی
۳-۳۸- مشخصات آماری SNPهای بالقوه و واقعی در دسته سوم
۳-۳۹- مشخصات آماری SNPهای واقعی و هاپلوتیپها در دسته سوم
۳-۴۰- مشخصات کامل SNPهای بالقوه در دسته سوم
۳-۴۱- مشخصات مورفولوژیکی سه هاپلوتیپ شناخته شده در آزمایش
ز
مقدمه:
افزون بر ۲۰% از اراضی کشاورزی و نزدیک به نیمی از زمین های آبی در دنیا متأثر از مشکل شوری هستند که این، عامل محدود کننده رشد و نمو گیاهان در سراسر جهان و مشکلی جدی برای تولید محصول کشاورزی میباشد (۲۸). شوری خاک یکی از مهمترین مشکلات محیطی است که تولید محصول زراعی را تحت تاثیر قرار میدهد (۵۱). لذا، فهم مکانیسم های تحمل به شوری بسیار با اهمیت است (۱۵). عملکرد گیاهان زراعی تحت تأثیر تنشهای زنده و غیر زنده بیش از ۵۰% کاهش مییابد (۱۴۶). افزایش شوری خاک یا آب موجب ایجاد اختلال در فرآیندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه شده و باعث بروز مشکلاتی مانند ۱) عدم تعادل یونی ۲) کمبود مواد معدنی ۳) تنش اسمزی ۴) سمَیَت یونی و تنش اکسیداتیو میگردد (۶۴). این شرایط با اجزای سلولی همانند DNA، لیپیدها و رنگدانه ها اثر متقابل مییابد (۱۳۴) و رشد و نموَ اکثر گیاهان زراعی را کاهش میدهد. تحمل نسبت به شوری صفتی چند ژنی است که شامل الف) تقسیم بندی مقادیر زیاد نمک در داخل گیاه ب) تنظیم اسمزی و ج) تغییرات مورفولوژیکی میباشد (۸۴). مطالعاتی که در زمینه تحمل به تنش شوری انجام گرفته است شامل: ۱- برنامه های اصلاح کلاسیک که علی رغم برخی موفقیتها، به دلیل ماهیت چند ژنی بودن این صفت محدود گردیده است، ۲- استفاده از موتاسیونهایی که منجر به از بین رفتن و حذف عملکرد ژن میگردند برای شناسائی و مطالعه ژنهای مسئول تنش. برای مثال در آرابیدوپسیس، به دلیل سهولت در دستکاری ژنتیکی این گیاه (۶)، تحقیقاتی در این زمینه انجام گرفته است و ۳- روش های کشت آزمایشگاهی در گیاهانی مانند یونجه (۱۵۴)، برنج (۷۷ و ۱۵۵) و سیب زمینی (۹۳) میباشد. توسعه گیاهان دارای پتانسیل ژنتیکی بالقوه برای تحمل نسبت به این تنش، به کاهش استفاده از آب نیز کمک می کند (۲۷). افزایش گیاهان متحمل (۱۲۴) همراه با مهندسی ژنتیک نتایج خوبی را از نظر احتمال انتقال سریع و دقیق صفات مطلوب به داخل گیاهان مورد نظر، بدون حضور ژن های مضر از خویشاوندان نزدیک گیاه، نشان داده است (۱۱۱). زیرا در این روش، از انتقال مناطق ناخواسته کروموزومی ممانعت میگردد (۱۱۲ و ۲۰). استفاده از ظرفیت داخلی گیاه، تحمل آن نسبت به این تنش را تقویت می کند و مهندسی ژنتیک مدرن به انتقال صفات مطلوب کمک مینماید (۹۴).
جو یکی از متحملترین گیاهان زراعی است که طی سالها، از روشهای مختلف فیزیولوژیکی برای تعیین تنوع فنوتیپی تحمل به شوری در این گیاه استفاده شده است (۱۴۹). ذخایر ژنی جوی زراعی در مقایسه با انواع وحشی آن تنوع ژنتیکی محدودی را نشان دادند که این امر بیانگر لزوم توسعه ارقام سازگار میباشد (۱۰۵). گزارش شده است که جمعیت هایی که در مناطق تحت تنش شوری رشد مییابند دارای تنوع ژنتیکی گستردهتری هستند (۸۸). از نظر میزان محصول دانه در محیط شور، جو یکی از اعضای متحمل به شوری در تیره تریتیاسه است (۶۹). مکانیسم تحمل به شوری در این تیره عموماً شامل تجمع یون سدیم در طول دوره رشد گیاه میباشد (۱۵ و ۱۳۸). از نقطه نظر تجمع این یون در تیره تریتیاسه، گیاه جو دارای تنوع ژنتیکی بالایی است. شوری یکی از موانع اصلی افزایش تولید محصول در جو بوده و تحمل به این تنش در مراحل مختلف رشد گیاه متفاوت است. حساسترین مراحل رشد گیاه در مقابل تنش شوری در جو دو مرحله جوانه زنی و گیاهچگی میباشد و با افزایش سن گیاه میزان تحمل آن نیز افزایش مییابد. تأثیر این تنش در مرحله جوانه زنی جو بیشتر مربوط به اثرات یونی است (۱۳۴)، در حالیکه در مرحله گیاهچگی تنش شوری حاصل اثرات اسمزی میباشد (۷۴). بین تحمل به شوری در دو مرحله رشدی جوانهزنی و گیاهچگی هیچ رابطهای وجود ندارد (۷۴). مکانیسمهای تحمل به شوری در جو شامل موارد زیر است: ۱- انتقال یون سدیم از برگهای گیاه جو به داخل واکوئول که موجب کاهش سمَیَت این یون می شود (۳۸) و ۲- توزیع بیشتر یون پتاسیم موجود در برگهای جو به داخل سلولهای مزوفیل نسبت به توزیع آنها در سلولهای اپیدرم که موجب افزایش نسبت یونی پتاسیم به سدیم در سیتوپلاسم سلولهای مزوفیل می شود و این وضعیت برای ثبات فتوسنتز با اهمیت است (۵۶).
استراتژی های حفاظت در مقابل آسیب ناشی از شوری در جو عبارت از استراتژی های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی است. تغییر عملکرد ژن راهی موثر برای تغییر این وضعیت است. بنابراین یک مرحله اساسی، درک مکانیسم مولکولی پاسخ به تنش است که در این مرحله، ژنهای کنترل کننده تنش و گیاهان ترانس ژنیک دارای تحمل بالا نسبت به این تنش شناسایی می گردند (۶۵).
دو ژن CBL4 و HKT1 نقش مهمی در تحمل گیاه جو نسبت به تنش شوری دارند که نقش و اهمیت آنها به طور خلاصه ذکر میگردد. سیگنالهای حاصل از یون کلسیم، مبدَلها و تنظیم کننده های اصلی در فرآیندهای سازگاری و نموَی گیاهان هستند. این سیگنالها به واسطه اثرات تحریکی خاص ناشی از فعال شدن همزمان کانالها، پمپها و انتقال دهندههایی که به صورت دمائی و فضایی افزایش یون کلسیم را نشان می دهند، بروز مییابند (۵۹). مشخصترین مسیر سیگنالدهی که مختص تنش شوری است نیز شامل افزایش یون کلسیم در سیتوسول میباشد (۱۶۱). در این مسیر، افزایش القائی یون سدیم در سیتوسول احتمالاً از طریق یک پروتئین calcineurin B-like به نام CBL4 که اصولاً تحت عنوان SOS3 شناخته شده است، تشخیص داده می شود. کمپلکس CBL4/CIPK24 (SOS3/SOS2) از طریق زنجیره اسید چرب مریستول با CBL4/SOS3 پیوند کووالانسی تشکیل میدهد (Ishitani, 2000) که موجب فسفریلاسیون و در نتیجه فعال شدن آنتی ریپورتر Na+/H+ موجود در بخش مرزی غشاء یعنی SOS1 میگردد (۱۰۴، ۱۰۶ و ۱۲۶). سیستم سیگنالدهی CBL/CIPK برای ترجمه سیگنالهای یون کلسیم به شکل فسفریلاسیون پروتئینی است که کمپلکسهای شرکت کننده در پروتئینهای CBL و CIPK هایی را که با آنها اثر متقابل دارند، مانند AKT1، ترانسپورتر یون پتاسیم در آرابیدوپسیس یا SOS1، عامل حساسیت عمومی نسبت به شوری یا CHL، ترانسپورتر نیترات یا AHA2 و H+ATPase 2 در آرابیدوپسیس، را مشخص می کند (۸۶). چند نوع CBL وجود دارد مانند CBL1، CBL4 و CBL9، که با اعضای غشائی در ارتباط هستند (۵۴ و ۶۸). در مورد CBL4/SOS3، نشان داده شده است که مریستوله شدن برای تحمل به شوری مهم و ضروری بوده است (۵۴). اولین CBL شناخته شده با روش ژنتیکی SOS3/CBL4 بوده است. این نشان میدهد که SOS3/CBL4 در تحمل به شوری از طریق حسگر یون کلسیم دارای نقش اختصاصی میباشد. ژنهایی که گیاه را قادر به محدود کردن تجمع یون سدیم در بافت شاخه مینمایند دارای منابع بالقوهای از تحمل نسبت به شوری در اصلاح نباتات هستند. در جو، لوکوس HvNaX4 مقدار یون سدیم در شاخه را بین ۱۲ و ۵۹ درصد کاهش میدهد. بسته به شرایط هیدروپونیک و نوع خاک تأثیر قوی محیط روی بیان این ژن مشخص میگردد (۱۱۲). لوکوس ژنی HvCBL4 در جو با ژن متحمل به شوری SOS3 در آرابیدوپسیس همولوگ بوده و با HvNaX4 به طور همزمان تفرق مییابد (۱۱۲).
تحمل به شوری در گیاهان می تواند وابسته به عامل انتقال دهنده HKT[1] باشد که این مولکول اختصاصاً انتقال یونهای سدیم یا انتقال یونهای سدیم و پتاسیم را تسهیل مینماید (۸۶ و۱۳۲) و در تنظیم هموستازی یون سدیم نقش مهمی ایفاء می کند. در آرابیدوپسیس تالیانا تنها یک ژنHKT (144) و در برنج ۸ ژنHKT (33 و ۴۸) وجود دارد. این ژن براساس تشابه توالی آمینو اسیدی دارای دو زیر خانواده میباشد (۱۰۰) که آنها از نظر انتخاب دو یون سدیم و پتاسیم متفاوت هستند ((۳۳، ۴۸ و ۷۲). اعضای ژنی زیر خانواده اول همگی اجزای انتقال دهنده اختصاصی یون سدیم بوده و اعضای زیر خانواده دوم انتقال دهنده همزمان دو یون سدیم و پتاسیم یا انتقال تک یون سدیم و یا پتاسیم می باشند به استثنای ژن OsHKT2,2 (Oshkt2) در برنج.
شکل ۱- شبکه سیگنالدهی CBL-CIPK در پاسخ به تنشهای غیر زنده
محققان گزارش دادند که تحمل نسبت به شوری به طور معنی داری با نسبت یون پتاسیم به یون سدیم مرتبط است (۱۰۵). آنالیز ترکیبی نشان داد که HvHKT1 اصولاً انتقال یون سدیم را تحت شرایط تنش کنترل می کند، که این نتیجه گیری با آنالیز بیشتر بیان ژن تأیید گردید. همچنین گزارش شده است که در جمعیتهایی که در محیط تحت تأثیر تنش رشد مییابند، طیف وسیعی از تنوع ژنتیکی وجود دارد (۸۸). در جو، مطالعه شده است که بیان ژن HKT1 به وسیله یون پتاسیم تنظیم می شود (۱۵۰). همچنین گزارش شده است که خانوادههای ژن HKT در هموستازی یون سدیم نسبت به یون پتاسیم دخالت مینمایند که این نشان دهنده اهمیت آنها در تحمل نسبت به شوری است (۴۳). چند مکانیسم در سازگاریهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی دخالت دارند که احتمالاً در حفظ نسبت پائین یون سدیم به یون پتاسیم در سیتوپلاسم نقش دارند. در جو (هوردئوم وولگار)، دو تا از این مکانیسمها وجود دارد که شامل انتقال یون سدیم به داخل واکوئول در عرض غشای تونوپلاستی و انتقال یون سدیم به محیط خارج در سراسر غشای پلاسمائی میباشد (۳۲ و ۹۹). توزیع درون سلولی یون سدیم شامل پمپاژ این یون به داخل واکوئول قبل از افزایش غلظت آن در سیتوپلاسم است (۱۳۸). این فرایند از طریق یک شیب گرادیانت pH که به وسیله جابجایی پروتونی H+-ATPase و پیروفسفاتاز غیر آلی ایجاد میگردد، تسریع می شود (۳۱، ۳۷، ۶۲ و ۱۴۵). افزایش فعالیت آنتیریپورتر Na+/H+ به دلیل افزایش یون سدیم در ریشه های هوردئوم وولگار گزارش شده است (۳۲). مطالعات متعدد اخیر وجود تنوع در تحمل به شوری در میان ارقام هوردئوم وولگار را گزارش نموده است (۶۶ و ۱۱۵). تحمل به شوری در گیاهان بستگی به ترانسپورترهای HKT دارد که این ترانسپورترها واسطه انتقال اختصاصی یون سدیم یا انتقال همزمان یون سدیم و پتاسیم هستند. ترانسپورترهای HKT دارای دو نقش میباشند: ۱- جذب یون سدیم از محلول خاک برای کاهش یون پتاسیم مورد نیاز هنگامی که یون پتاسیم عامل محدود کننده است و ۲- کاهش تجمع یون سدیم در برگها با انتقال آنها به داخل فضای آوند چوبی و یا انتقال آنها به داخل فضای آوند آبکش (۱۱۳).
شکل۲- مسیر اختصاصی سیگنال دهی گیاه در پاسخ به تنش شوری (۸۶)
تکنیک اکوتیلینگ
تعیین خصوصیات فنوتیپی جمعیتهای بزرگ یا مجموعههای بزرگ بانک ژنی مشکل و دشوار است. راهحل آن، استفاده از روشی برای صرفه جوئی در زمان و هزینه میباشد. همچنین، توانایی عملی برای تأیید نقش توالیهای ژنی که از طریق برنامه های بررسی بیان توالی ژن در آزمایشات بزرگ به دست میآیند متناسب با سرعت کشف و یافتن آنها نمی باشد. در نتیجه، تعداد زیادی توالی DNA وجود دارد که از طریق تفسیر الکترونیکی با ژنها یا پروتئینهایی که قبلاً خصوصیات آنها تعیین شده همولوژی ندارند و بدین وسیله هیچ عملکرد بالقوهای برای آنها در نظر گرفته نمی شود (۱۱). به علت وجود اطلاعات زیاد در مورد توالیهای ژنی و فقدان آگاهی از عملکرد و نقش آنها، و نیز برای پر کردن فاصله بین ساختار و نقش این توالیها تحقیقات زیادی در زمینه ژنتیک معکوس انجام گرفته است (۶۴). با بهره گرفتن از ابزار مولکولی و ژنتیکی، یک صفت موتانت با یک توالی از DNA که عملکرد آن قبلاً شناخته شده است، مرتبط میگردد (۱۷ و ۴۶). اکوتیلینگ روشی است که با آن میتوان به سرعت و به سادگی پلیمورفیسمهای طبیعی (پلیمورفیسمهای تک نوکلئوتیدی (SNP) یا حذف و اضافههای کوچک) را در ژن مورد نظر تعیین نمود (۱۶). این تکنیک بر مبنای تشخیص موتاسیون است و اولین بار توسط کومای و همکاران معرفی گردید که در واقع از تکنیک تیلینگ برای یافتن موتاسیون در جمعیت طبیعی آرابیدوپسیس تالیانا استفاده گردید. این روش برای جو(Hordeum vulgar L.) (76)، هندوانه (Cucumis melo L.) (91)، گندم(Triticum aestivum L.) (152)، بادام زمینی وحشی (Arachis duranensis K & G) (109) و در تعدادی از گیاهان آبزی مانند (Monochoria vaginalis B.)(151) به کار برده شد. با بهره گرفتن از این روش، تعیین آللهای مختلف ژنهای هدف و کاهش تعداد نمونههایی که باید تعیین فنوتیپ گردند، امکان پذیر می شود. معمولترین شکل تنوع ژنتیکی SNP است، به خصوص آللهای نادری که فراوانی آنها کمتر از ۵% است نقش مهمی در فنوتیپ ایفاء مینمایند. اثرات بسیار مؤثر آللهای نادر روی صفات کمّی و بیماریهای پیچیده در تحقیقات زیادی گزارش شده است (۱۴ و ۱۱۴). برخی از SNP ها از طریق تغییر توالی آمینو اسید یا ناقص کردن پروتئینها عملکرد ژن را تغییر می دهند (۱۰۹).
مزیتهای تکنیک اکوتیلینگ شامل موارد زیر است: ۱- این تکنیک در همه گیاهان و جانوران، حتی گونه هایی که قادر به موتانت زایی نیستند، قابل کاربرد است (۳۵)، ۲- قابلیت تعیین تنوع در تعداد تکرار ستلایتها (SSRs) را دارد (۱۳۹)، ۳- قابلیت تعیین سطوح هتروزیگوسیتی در گونه های دگرگشن با هتروزیگوسیتی بالا را دارد (۳۵) و ۴- ظرفیت تشخیص پلی مورفیسمهای چند گانه در یک قطعه مجزا را دارد (۱۳۹). مزایای تکنیکی روش اکوتیلینگ در مقایسه با سایر روشهای مولکولی به این دلیل است که روشهای ارزیابی بر اساس حرکت ژل، مانند الکتروفورز ژل گرادیانت (DGGE) و پلی مورفیسمهای تک رشتهای (SSCP) قادر نیستند محل و نوع پلی مورفیسم در قطعه DNA را تعیین کنند (۲۱). تکنیکهای دنیچره کردن و PCR نیز صرفاً برای قطعات کوچک DNA استفاده میشوند و تکنیک مبتنی بر آرایه می تواند ۵۰% از SNPها را بیابد و در این میان، روش توالییابی برای این منظور بسیار مناسب و دقیق میباشد. این روش در گذشته برای ارزیابی جمعیتهای بسیار بزرگ پر هزینه بود اما امروزه با پیشرفت سریع در تکنیکهای توالییابی به عنوان روشی کم هزینهتر و با راندمان بالاتر و همچنین استفاده از نرم افزارهایی که تجزیه و تحلیل داده های توالییابی را تسریع و تسهیل می کنند، کاربرد این تکنیک بیش از پیش مورد توجه قرار گرفته است. به گونه ای که اخیراً یکی از جدیدترین تکنیکهای تیلینگ و اکوتیلینگ انجام این روشها با بهره گرفتن از توالییابی است که با صرف هزینه کمتر و در مدت زمان کوتاهتر برای مطالعه تنوع در ژنهای چند آللی در جمعیتهای موتانت و طبیعی به کار میرود. با بهره گرفتن از روش توالییابی، ضمن برخورداری از کلیه مزایای تیلینگ و اکوتیلینگ، میزان سرعت و دقت در یافتن پلی مورفیسمهای تک نوکلئوتیدی و نیز سایر انواع پلی مورفیسمها به حداکثر میرسد (۳۵).
هدف از این تحقیق، تعیین تنوع آللی ژنهای کاندیدای تحمل به تنش شوری در ارقام و ژنوتیپهای جو، جستجوی آللهای جدید، آنالیز روابط فیلوژنی میان ژنوتیپهای مورد مطالعه، و طبقه بندی ژنوتیپها در قالب گروه های هاپلوتیپی بوده است. بدین منظور، از تکنیک اکوتیلینگ به کمک توالی یابی[۲] که یک تکنیک مدرن و بسیار کارآ میباشد برای یافتن انواع پلیمورفیسمهای نوکلئوتیدی در دو ژن CBL4 و HvHKT1 (ژنهای کنترل کننده تنش شوری) در ارقام مورد مطالعه جو در این تحقیق استفاده گردیده است. این دو ژن در کنترل شوری نقش بسیار مهم و اساسی دارند. در مطالعه حاضر، از تنوع نوکلئوتیدی این ژنها در ارقام و ژنوتیپهای متعلق به مناطق مختلف شور در دنیا برای یافتن منابع جدید و بالقوه تحمل به تنش شوری استفاده شده است. ضرورت انجام چنین تحقیقی این بوده است که علیرغم تحقیقات فراوان در زمینه اصلاحات ژنتیکی و وجود مکانیسمهای سازگاری، بسیاری از گیاهان با مشکل کاهش عملکرد مواجه میباشند. یکی از عوامل اصلی کاهش عملکرد در گیاهان به ویژه گیاهان زراعی، اثرات سوء تنشهای غیر زنده است. از میان تنشهای غیر زنده، تنش شوری یکی از عوامل بسیار مهم کاهش عملکرد و هدر رفتن محصول گیاهی است. لذا، این تحقیق با هدف یافتن منابع بالقوه مقاومت به شوری در ژنوتیپهای جو اجرا گردیده است.
فصل اول- بررسی منابع:
پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) به صورت یک تغییر تک بازی در توالی DNA که با نسبت معنی داری (بیش از یک درصد) در یک جمعیت بزرگ اتفاق میافتد، تعریف می شود. SNPها در سراسر ژنوم در چهارچوب الگوهای خاصی به نام بلوک هاپلوتیپی حفظ میگردند. پلیمورفیسمهای SNP به این دلیل مفید هستند که اغلب با یک صفت خاص مرتبط میباشند و به آنها صفات وابسته به ژنتیک گفته می شود. هاپلوتیپها مجموعه ای از مارکرهای ژنتیکی پیوسته با هم روی یک کروموزوم هستند که با یکدیگر توارث مییابند و با نوترکیبی به راحتی از یکدیگر جدا نمیشوند. از تکنیک اکوتیلینگ میتوان برای طبقه بندی هاپلوتیپی ژنوتیپها استفاده نمود. اولین بار، کومای و همکاران (۲۰۰۴) با بهره گرفتن از تکنیک اکوتیلینگ پلیمورفیسم DNA را در جمعیتهای طبیعی آرابیدوپسیس تالیانا مطالعه نمودند. آنها در ۵ ژن از ۱۵۰ گیاه، ۵۵ هاپلوتیپ یافتند که این هاپلوتیپها طیفی از تفاوتها از جمله پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی تا هاپلوتیپهای پیچیده را نشان دادند. کوکرام و همکاران (۲۰۰۷) نیز با کمک این تکنیک هاپلوتیپهای دو ژن VRN-H1 و VRN-H2 را در ۴۲۹ واریته جو تعیین نمودند. آنالیز ژنوتیپی، داده های توالییابی اینترون یک و آزمونهای عادت رشدی این گیاه وجود سه آلل جدید VRN-H1 را نشان داد و فراوانترین نوآراییهای اینترون یک را تعیین نمود. آنالیز ترکیبی آللهای VRN-H1 و VRN-H2 موجب طبقه بندی ۷ هاپلوتیپ چند لوکوسی VRNH1/VRNH2 گردید که سه تا از آنها در ۷۹% از واریتهها وجود داشتند. سینگ و همکاران (۲۰۱۰) هاپلوتیپهای SNP در ژن BADH1 را در ۱۲۷ واریته و نژاد بومی برنج مورد مطالعه قرار دارند. محصول پروتئینی این ژن (بتائین گلیسین) آنزیمی است که در بسیاری از گونه ها به عنوان یک اسموپروتکتنت قوی در مقابل تنش شوری و خشکی عمل می کند. این محققان از طریق توالییابی مجدد واریتههای مختلف برنج که از نظر تحمل به شوری و داشتن عطر متنوع هستند SNPهای مربوط به ژن BADH1 را پیدا نموده و تأیید کردند. آنها SNP 17 در اینترون و SNP 3 در اگزون یافتند که هر سه SNP اگزونی موجب تغییردر آمینو اسید همراه با تغییر معنیدار عملکرد ژن گردیدند. در ارزیابیهای مرکب SNP در ۱۲۷ واریته مختلف برنج مجموعاً ۱۵ هاپلوتیپ گزارش گردید که ۴ تا از آنها با دو هاپلوتیپ پروتئینی مرتبط بودند و در ۸۵% از ارقام وجود داشتند. نتایج این مطالعه نشان داد که واریتههای معطر برنج رابطه خاصی با هاپلوتیپ پروتئینی BADH1 که موجب تبدیل اسید آمینههای لیزین به آسپاراژین و لیزین به گلوتامین گردید، نشان دادند. چن و همکاران (۲۰۱۱) با بهره گرفتن از روش تغییر یافته اکوتیلینگ، SNPهای ژن VRN-A1 را در گندم (Triticum aestivum L.) تعیین نمودند. آنها SNP های این ژن را در ۱۰۶ ژنوتیپ از واریتههای هگزاپلوئید گندم جستجو کرده و از فنوتیپ زمستانه یا بهاره بودن برای طبقه بندی هاپلوتیپی آنها استفاده کردند. آنها سه هاپلوتیپ، هر یک با ۵، ۶ و ۳ تغییر نوکلئوتیدی یافتند. سه تا از این SNPها با بهاره بودن گندم مرتبط بود. آنها از اکوتیلینگ قطعات DNA روی ژل آگارز برای تشخیص SNPها استفاده کردند و گزارش نمودند که این روش برای تعیین SNPها در ژنهای گیاهان پلیپلوئید مانند گندم کارآیی دارد. ژانگ و همکاران (۲۰۱۱) ژن desmoglein 4 (DSG4) در گوسفند را که نقش مهمی در تنظیم رشد و تمایز فولیکولهای مو در پستانداران دارد مورد مطالعه قرار دادند. آنها یک قطعه bp 755 از این ژن را در ۵۴۴ نمونه گوسفند متعلق به ۹ نژاد بومی چین و دو نژاد غربی غربال نموده و در دو قطعه از سه قطعه مورد بررسی پلی مورفیسم مشاهده کردند. نکته جالب این بود که پلیمورفیسمها در این دو قطعه دارای عدم تعادل لینکاژی قویی بودند. آنها سه هاپلوتیپ یافتند. توالیهای سه هاپلوتیپ ۷ پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNPs) و یک حذف و اضافه TTG را نشان دادند که موجب جابجایی ۵ آمینواسید و حذف و اضافه آمینو اسید گلیسن گردید. شبیر و همکاران (۲۰۱۱) در دو نژاد بوفالوی جعفر آبادی و سورتی هاپلوتیپها و فیلوژنی مرتبط با ۲۰ توالی نوکلئوتیدی ژن OLR1 را آنالیز و بررسی نمودند. آنها در جمعیت مورد مطالعه خود چهار هاپلوتیپ با فراوانیهای ۰۵/۰، ۱/۰، ۱۵/۰ و ۷/۰ یافتند. همچنین آنها داده های خود را براساس همولوژی مناطق ژنی مورد بررسی در چهار گروه طبقه بندی نمودند. بنابراین نتیجه گیری میگردد که تکنیک اکوتیلینگ کارآئی بالایی در طبقه بندی هاپلوتیپها، تعیین رابطه آنها با صفات مورفولوژیکی و تخمین فراوانی آنها دارد.
